蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篇之蛋白樣品制備

開(kāi)篇之際，首先來(lái)看看這兩句話：
“在制備中丟失的蛋白是永遠(yuǎn)不可能在后面的實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)回來(lái)的”，
“讓我們把蛋白質(zhì)看作是具有*而奇妙性質(zhì)的實(shí)體”。

蛋白樣品制備是許多實(shí)驗(yàn)重要的*步，蛋白樣品由于其結(jié)構(gòu)特性各異，又必須使其*溶解和盡可能少的化學(xué)修飾，所以不可能有一個(gè)通用的技術(shù)，只能通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)積累經(jīng)驗(yàn)。正如開(kāi)篇所引用的兩句話中包含的深意：在研究蛋白的過(guò)程中，既需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)流程，規(guī)范的操作手段來(lái)確保蛋白研究的完整性，也需要將其看成是*而奇妙的個(gè)體，結(jié)合以往經(jīng)驗(yàn)但又不拘泥于經(jīng)驗(yàn)，才能真正揭開(kāi)她神秘的面紗。2012年讓我們一起來(lái)回顧一下這一重要技術(shù)及值得關(guān)注的產(chǎn)品。

為什么要進(jìn)行樣品制備

“為什么要進(jìn)行樣品制備？電泳的目的不就是分離嗎？”剛接觸雙向電泳的小菜鳥(niǎo)有可能就會(huì)這么問(wèn)。這個(gè)問(wèn)題很好回答，這是由于目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot)，而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬(wàn)種以上，因此樣品的預(yù)分離制備是必須的。另外比如像對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行研究，尋找疾病標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的，由于臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類細(xì)胞，而這類細(xì)胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。所以常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，實(shí)際上是多種細(xì)胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較，而蛋白質(zhì)組研究的通常是單一的細(xì)胞類型，因此需要進(jìn)行有效的樣品制備。

但是為什么要進(jìn)行不同步驟的樣品制備呢？這不僅僅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法來(lái)配合，而且在制備樣品的時(shí)候，首先需要明確的是什么是實(shí)驗(yàn)的zui終目的：是分離盡可能多的蛋白還是分離樣品中某些感興趣的蛋白，這些直接決定了你的制備方法，也決定了實(shí)驗(yàn)的成功與否。由于想要分離的蛋白必須是*溶解的，溶解的效果取決于裂解、破碎、沉淀、溶解的過(guò)程以及去污劑的選擇和各種溶液的組成，因此如果是只對(duì)樣品中的一部分蛋白感興趣，可采取預(yù)分離的方法，如欲分析的蛋白來(lái)自細(xì)胞器（細(xì)胞核、線粒體和原生質(zhì)膜），則應(yīng)先采取超速離心或其他方法將細(xì)胞器分離出來(lái)再溶解蛋白；如果是希望分離出盡可能多的蛋白，比如進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，則可以將細(xì)胞或組織中的蛋白分成幾部分，分級(jí)制備。

G Biosciences 小貼士：制備的原則：

1. 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。
2. 防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。
3. 防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。
4. *去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。
5. 盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。

以上這五項(xiàng)原則是科學(xué)家們的經(jīng)驗(yàn)智慧總結(jié)，基本上可以說(shuō)是囊括了樣品制備過(guò)程中的抽象注意事項(xiàng)，之后還會(huì)提到具體的注意事項(xiàng)。

樣品制備流程

蛋白樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除雜質(zhì)。雖然說(shuō)出來(lái)不過(guò)寥寥的十個(gè)字，但是這幾個(gè)過(guò)程經(jīng)過(guò)這么多年，恐怕還沒(méi)有那位研究人員可以說(shuō)自己已經(jīng)*掌握，面對(duì)任何蛋白制備手到擒來(lái)。

破碎——zui小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原則

樣品制備的*步當(dāng)然是細(xì)胞或者其它樣品的破碎，這一步看似簡(jiǎn)單，但是操作中一旦方法不當(dāng)，就有可能會(huì)丟失樣品中的蛋白和導(dǎo)致蛋白被修飾。要想毫發(fā)無(wú)損的通過(guò)這一關(guān)，首先就要分析樣品的來(lái)源，是易碎的細(xì)胞還是堅(jiān)硬的組織？是植物細(xì)胞還是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。

破碎的方法有許多種，包括循環(huán)凍融法、滲透法、去污劑法、酶裂解法、超聲波法、高壓法、液氮研磨法、機(jī)械勻漿法和玻璃珠破碎法等（可以歸納為機(jī)械法、化學(xué)法和物理法），這些方法有不同的應(yīng)用范圍，基本的原則都是要以zui小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解變性，這也就是在樣品制備破碎這一步的關(guān)鍵所在。抑制蛋白酶降解，減少操作過(guò)程溫度或者其他物理化學(xué)條件對(duì)蛋白質(zhì)變性的影響，減少核酸污染對(duì)后繼電泳等分析的污染，都是破碎過(guò)程需要考慮的問(wèn)題。

為了達(dá)到更好的后續(xù)抽提效果，G Biosciences發(fā)明了一種用于樣本研磨的小工具，或許可以給你帶來(lái)事半功倍的效果。EZ-Grind是一種分裝到1.5ml的研磨管中的的研磨樹(shù)脂，同時(shí)配套有研磨棒。樹(shù)脂用于zui適的研磨生物樣本從而來(lái)提取蛋白和DNA，同時(shí)樹(shù)脂是中性摩擦材質(zhì)不會(huì)結(jié)合蛋白或核酸。樹(shù)脂，研磨棒，研磨管的配套組合可以破壞組織，細(xì)胞，細(xì)胞核和其他細(xì)胞器。它以做到10分鐘內(nèi)一個(gè)管里可以處理100mg樣本，這個(gè)小產(chǎn)品價(jià)格不高，但是非常實(shí)用，真正想科學(xué)家之所想，建議你不妨一試，或許還有驚喜。

蛋白樣本制備的目標(biāo)簡(jiǎn)言之“三高”，保留活性高，回收產(chǎn)量高，工作效率高。“三高”是苦中作樂(lè)的說(shuō)法，說(shuō)的輕松，這頭一條“保留活性高”便是蛋白樣品制備的痛中之痛----樣品制備過(guò)程導(dǎo)致的蛋白變性和隨后的復(fù)性工作是很令人頭痛的問(wèn)題。這些年來(lái)以G Biosciences為代表的以蛋白質(zhì)研究為核心研發(fā)的公司開(kāi)發(fā)了一系列蛋白抽提試劑，大大簡(jiǎn)化了樣品制備工作的煩惱，更重要的是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。

八仙過(guò)海，各顯神通-Focus系列抽提試劑盒，讓你的抽提不再是事兒！

針對(duì)各種常見(jiàn)樣本的抽提，G Biosciences旗下的Focus系列抽提試劑盒可謂是八仙過(guò)海，為你帶來(lái)了是蛋白質(zhì)樣本抽提綜合解決方案。如果你的目的是研究蛋白質(zhì)特性，把時(shí)間都耗在純化過(guò)程中那太費(fèi)時(shí)間，看準(zhǔn)目標(biāo)，蛋白純化也可以連同初步純化一步到位。這類試劑盒通常在裂解細(xì)胞的同時(shí)利用某些共性初步分離蛋白質(zhì)，令產(chǎn)品分段收集，使得在后繼的電泳分析中減少背景蛋白的復(fù)雜程度，提高蛋白電泳分辨率。下面讓我們對(duì)這些“神通”一一進(jìn)行解析。

各顯神通之*式-哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)組抽提

FOCUS™ 哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)組抽提試劑盒-從哺乳動(dòng)物樣本中抽提和溶解幾乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白，通過(guò)一個(gè)強(qiáng)烈的離液劑抽提緩沖液來(lái)溶解甚至zui難溶解的蛋白。適用于哺乳動(dòng)物組織和貼壁&懸浮細(xì)胞等生物樣本。它可以一步提取實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)提供有一個(gè)強(qiáng)烈的離液劑抽提緩沖液，用于50X100mg動(dòng)物組織或50微升濕細(xì)胞團(tuán)樣本制備應(yīng)用，從哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中提取總蛋白，適用于樣本制備用于2D凝膠電泳和其他應(yīng)用。

各顯神通之第二式-蛋白質(zhì)組分級(jí)分離

FOCUS™蛋白質(zhì)組分級(jí)分離試劑盒-用來(lái)將復(fù)雜的生物樣本分級(jí)分離為胞質(zhì)蛋白和膜蛋白。zui終得到的膜蛋白隨后分級(jí)分離成周邊蛋白和膜內(nèi)嵌蛋白或脂筏相關(guān)的蛋白和去污劑溶解的膜蛋白。該試劑盒可以進(jìn)行大于50次的實(shí)驗(yàn)，它的“法力”包括：用于分級(jí)分離內(nèi)嵌蛋白，周邊蛋白以及脂筏相關(guān)蛋白的組分，分級(jí)分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)組到多個(gè)組分，從組織，細(xì)胞，植物，酵母，細(xì)菌，昆蟲(chóng)和其他樣本來(lái)源中分級(jí)分離得到膜蛋白，從脂筏中分級(jí)分離得到膜蛋白，用于下游的應(yīng)用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質(zhì)譜，適用于蛋白質(zhì)組和細(xì)胞信號(hào)研究。

各顯神通之第三式-酵母蛋白質(zhì)組抽提

FOCUS™ 酵母蛋白質(zhì)組抽提試劑盒-特定性設(shè)計(jì)用于酵母研究同時(shí)提供酵母特定性的研究試劑。從酵母中抽提和溶解幾乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白。抽提是基于溫和的酵母細(xì)胞的裂解用一種酵母溶解酶。LongLife™ Zymolyase，這種酶提高了穩(wěn)定性和效期。酶反應(yīng)之后是用一起提供的強(qiáng)烈的離液劑抽提緩沖液進(jìn)行總蛋白質(zhì)組的抽提，這種抽提緩沖液能夠溶解甚至是zui難溶解的蛋白。它的“法力”包括：提供有酵母特異性的溶解酶和強(qiáng)烈的配方的離液劑抽提緩沖液；適用于50X60微升的酵母細(xì)胞塊的制備，從酵母細(xì)胞中提取總蛋白，適用于2D凝膠電泳和其他應(yīng)用的樣本制備。

各顯神通之第四式-膜蛋白抽提

FOCUS™膜蛋白抽提試劑盒-一種快速和高度重復(fù)性的方法用于從生物樣本中制備膜蛋白或疏水蛋白用于二維電泳或其他應(yīng)用。膜蛋白用相分配法一步法得到抽提，抽提效率大于90%同時(shí)帶有zui小的親水蛋白污染。試劑盒提供有必要的試劑用于抽提膜蛋白以及之后的制備過(guò)程用于等電聚焦或二維電泳從而得到提高的點(diǎn)分辨率。它的“法力”包括：基于相分離法的膜蛋白的抽提；從組織，細(xì)胞，植物，酵母，細(xì)菌，昆蟲(chóng)和其他樣本中選擇性的分級(jí)分離膜蛋白；適用于膜蛋白的制備用于一系列下游的應(yīng)用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質(zhì)譜

各顯神通之第五式-線粒體抽提

FOCUS線粒體抽提試劑盒-從培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抽提完整的線粒體。這個(gè)試劑盒可以快速的從培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)組分中抽提和富集線粒體。大于90%的線粒體保持完整的內(nèi)膜和外膜，從而保持功能和活性。試劑盒適用于動(dòng)物組織和其他來(lái)源的線粒體抽提，可以做50次實(shí)驗(yàn)，一次實(shí)驗(yàn)大約是2X10⁷哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者100mg的哺乳動(dòng)物組織。它的“法力”包括：快速的分級(jí)分離線粒體活性的重組分和輕組分；適用于培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞和組織；從動(dòng)物細(xì)胞和組織中抽提和富集線粒體的組分；適用于下游一系列應(yīng)用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質(zhì)譜。

各顯神通之第六式-亞細(xì)胞組分抽提

FOCUS亞細(xì)胞組分抽提試劑盒-從動(dòng)物細(xì)胞核組織中快速和容易的分離細(xì)胞核，線粒體，膜和胞質(zhì)組分。適用于培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物組織。它的“法力”包括：分級(jí)分離適用于一系列下游的應(yīng)用包括1D&2D電泳和免疫印跡；分離得到的線粒體大于90%是有活性的；適用于線粒體，細(xì)胞核，胞質(zhì)和膜組分的分級(jí)分離。

各顯神通之第七式-信號(hào)蛋白分離富集

FOCUS信號(hào)蛋白分離富集試劑盒-從其他細(xì)胞蛋白中分級(jí)分離脂筏定位蛋白，通過(guò)采用非離子去污劑的方法。信號(hào)蛋白抽提緩沖液是的非離子去污劑配方，可以的抽提和去除可溶性蛋白，剩下包含信號(hào)蛋白的脂筏作為不溶于去污劑的組分。zui后脂筏溶解于FOCUS蛋白溶解緩沖液中，和1種2D電泳兼容緩沖液或一種其他選擇的緩沖液。該試劑盒可以用來(lái)做50次實(shí)驗(yàn)，它的“法力”包括：分級(jí)分離脂筏定位蛋白；提供一個(gè)2D電泳兼容緩沖液；分離定位于脂筏上的信號(hào)蛋白；研究活化的蛋白在離開(kāi)和到達(dá)脂筏的移動(dòng)；適用于2D凝膠電泳，蛋白質(zhì)組和細(xì)胞信號(hào)研究。

各顯神通之第八式-磷酸化蛋白富集

細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路失調(diào)往往是引起癌變或者腫瘤發(fā)生的成因，其特征之一是信號(hào)通路成員蛋白質(zhì)的可逆磷酸化。因此研究細(xì)胞信號(hào)通路各關(guān)鍵分子的磷酸化水平是分析細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的研究重點(diǎn)之一。要從蕓蕓眾生中專門發(fā)掘磷酸化蛋白，你可能需要FOCUS Phosphorich磷酸化蛋白富集試劑盒。

FOCUS Phosphorich磷酸化蛋白富集試劑盒-一種即開(kāi)即用的試劑盒，能夠從復(fù)雜的生物學(xué)樣本中富集磷酸化的蛋白和磷酸化的肽。試劑盒中含有微量離心柱，柱內(nèi)的樹(shù)脂可以結(jié)合磷酸化的蛋白，結(jié)合量是每個(gè)柱子結(jié)合磷酸化的卵白蛋白大約20mg。通過(guò)再生和適當(dāng)儲(chǔ)存，柱子可以重復(fù)利用。它的“法力”包括：使用磷酸化蛋白結(jié)合離心柱；磷酸化蛋白的迅速結(jié)合和洗脫；富集磷酸化的蛋白和肽；適合于下游一系列應(yīng)用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質(zhì)譜；適合于蛋白質(zhì)組和細(xì)胞信號(hào)研究。

目前蛋白組學(xué)研究在世界尤其以中國(guó)為首的亞洲國(guó)家正如火如荼，更好的進(jìn)行樣本的抽提可以為下游的工作打好堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，FOCUS系列非常符合“三高”的理念要求，在世界*研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)使用的非常普遍，筆者建議你一試便知。